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黄曲霉毒素总量（B₁、B₂、G₁、G₂）免疫亲和柱使用说明书

产品编号：G800-21002

【产品用途】

黄曲霉毒素总量（AFT）免疫亲和柱适合于和HPLC、LC-MS及AFT酶免分析试剂盒结合使用，定量检测AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂。适用于谷物、食品、中药等样本中的AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的净化处理，提高了样品的纯度。纯化后的样品可用不同的分析方法测定。

【测定原理】

本产品测定的基础是抗原抗体反应，抗AFT的单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的AFT经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过AFT免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂分别与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。最后采用甲醇洗脱AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂，然后进行相关分析。

【所需材料】（不提供）

（1）设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、涡旋混匀仪或摇床（转速≥200r/min）；量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器（100μL~1000μL）、快速定性滤纸、玻璃微纤维滤纸（Whatman 934-AH，直径11cm，孔径1.5μm）、20mL玻璃注射器等。

（2）试剂：乙腈（色谱级）、甲醇（色谱级）、氯化钠、蒸馏水或去离子水。

【试剂配制】

PBS溶液：将PBS粉末（厂家提供）直接用900mL水全部溶解后，用HCl或NaOH调pH至7.4，最后用水定容至1L。

0.1%吐温20-PBS溶液：将0.1%吐温20-PBS粉末（厂家提供）直接用900mL水全部溶解后，用HCl或NaOH调pH至7.4，最后用水定容至1L。

1%吐温20-PBS溶液：将1%吐温20-PBS粉末（厂家提供）

直接用900mL水全部溶解后，用HCl或NaOH调pH至7.4，最后用水定容至1L。

5M NaOH溶液：称取20g NaOH，溶于100mL水中。

【样品制备】

（1）谷物、花生及其制品

----准确称取25g（精确至0.01g）粉碎的样品，加入5g氯化钠； 

----与125mL甲醇-水溶液（70+30，v/v）混合，摇床振荡提取15min；

----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min；

----准确移取15mL滤液或上清液，加入30mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用；

----准确移取15mL混匀滤液（相当于1.0g样品）过亲和柱。

（2）酱油

----准确称取50g（精确至0.01g）样品；

----加入甲醇-水溶液（80+20，v/v）至100mL，摇床振荡提取15min；

----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min；

----准确移取10mL滤液或上清液，加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用；

----准确移取10mL混匀滤液（相当于1.0g样品）过亲和柱。

（3）醋

----准确称取5g（精确至0.01g）样品，加入1g氯化钠； 

----用PBS稀释至25mL，摇床振荡提取15min；

----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min；

----取10mL滤液或上清液，加入10mL PBS稀释，将该混合液用5M NaOH调至pH7.0左右，用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清，备用；

----准确移取10mL混匀滤液（相当于1.0g样品）过亲和柱。

（4）坚果类制品

----准确称取10g（精确至0.01g）样品；

----加入40mL乙腈-水（84+16，v/v），摇床振荡提取15min；

----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min；

----准确移取4mL滤液或上清液，加入46mL 1%吐温20-PBS稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用；

----准确移取20mL混匀滤液（相当于0.4g样品）过亲和柱。

（5）中药、香料及茶叶

----准确称取10g（精确至0.01g）样品； 

----加入40mL乙腈-水（84+16，v/v），摇床振荡提取15min；

----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min；

----准确移取6mL滤液或上清液，加入54mL 1%吐温20-PBS稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用；

----准确移取40mL混匀滤液（相当于1.0g样品）过亲和柱。

【亲和柱净化】

注意：整个纯化过程尽量不要让柱子干燥！

----3mL柱管取出上方堵头，减去上堵头螺纹下突出部分，插回柱子上，另一端与20mL针筒固定后使用；将1mL柱管上方堵头取出后斜剪断，然后再插回柱子上（柱管内偶见有小气泡属正常现象，不影响亲和柱的使用）； 

----准确移取上述混匀滤液，注入针筒中，调节针筒压力使其以2秒/滴的速度缓慢通过免疫亲和柱；

----用20mL 水冲洗柱子（对于酱油、醋、中药等颜色比较深的样液，先用10mL0.1%吐温20-PBS清洗，再用10 mL10%甲醇-水冲洗柱子，最后用10mL水冲洗柱子。），流速1秒/滴，弃去流出液，直至2~3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体； 

----准确加入2.0mL甲醇（色谱级）洗脱，流速自然重力，直至2~3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体。收集全部洗脱液，进行相关测定。

【检测方法】

IAC-HPLC法检测

----过有机相滤膜（孔径0.22μm）后，直接HPLC测定；或在50℃下用氮气缓缓地吹至近干，加入流动相混匀，过有机相滤膜（孔径0.22μm）后，参照GB 5009.22-2016条件进行HPLC测定。

【注意事项】

（1）黄曲霉毒素对人体有害，应戴手套操作。凡接触到标样的玻璃器皿都要用5%次氯酸钠浸泡过夜。

（2）不要使用过有效期的免疫亲和柱。

（3）免疫亲和柱应在2~8℃保存。不要冷冻。

（4）使用前，免疫亲和柱需至少提前半小时回温至室温（25℃左右）。

（5）称取的样品量以及提取液的体积可根据实际情况按比例调整，建议最低不少于10g样。

（6）黄曲霉毒素对光线敏感，因此样品及其提取液应当低温（2~8℃）、避光保存。